蛋白质浓度测定的UV-Vis方法

一、蛋白质测定概述

1.1 蛋白质UV-Vis测定基础

蛋白质紫外吸收：
├─ 蛋白质含芳香氨基酸
│   ├─ 色氨酸（Trp）：λ=280nm
│   ├─ 酪氨酸（Tyr)：λ=280nm
│   └─ 苯丙氨酸（Phe)：λ=257nm
├─ 肽键：λ=190-210nm
└─ 吸收强度：Trp > Tyr > Phe

1.2 常用方法

方法分类：
├─ 直接法（紫外吸收）
│   ├─ A280法
│   └─ A205/215法
├─ 显色法
│   ├─ BCA法
│   ├─ Bradford法
│   ├─ Lowry法
│   └─ 考马斯亮蓝法
└─ 荧光法
    └─ Intrinsic fluorescence

二、直接紫外吸收法

2.1 A280法（280nm法）

原理：
├─ 蛋白质在280nm有吸收
├─ 主要来自Trp和Tyr
├─ Beer定律：A = εc·l
└─ 计算浓度

消光系数：
├─ 纯蛋白质：ε280 ≈ 1.0-2.0 mL/(mg·cm)
├─ 或εM ≈ 10^4-10^5 L/(mol·cm)
└─ 可通过氨基酸序列计算

2.2 计算公式

浓度计算：
C (mg/mL) = A280 / (ε1% × l)

ε1%：比吸光系数
A280：280nm吸光度
l：光程长度（cm）

或：
C (mg/mL) = A280 × 1.5 / l

（估算值，适合多数蛋白质）

2.3 优点与局限

优点：
├─ 快速简便
├─ 无试剂消耗
├─ 样品可回收
├─ 可在线监测
└─ 自动化

局限：
├─ 受核酸干扰
├─ 受小分子干扰
├─ 需要消光系数
└─ 灵敏度一般

三、BCA法

3.1 原理

BCA（bicinchoninic acid）法：
├─ 蛋白质 + Cu(II) → Cu(I)
├─ Cu(I) + BCA → 紫色络合物
├─ λ = 562nm
├─ 颜色强度 ∝ 蛋白质浓度
└─ 双缩脲反应增强版

3.2 优点

BCA法优点：
├─ 高灵敏度：A562nm
├─ 线性范围宽：0.02-2mg/mL
├─ 耐受剂型：SDS, Triton等
├─ 稳定性好：颜色稳定
└─ 操作简便

3.3 操作步骤

操作流程：
1. 配制BCA工作液（WR）
2. 标准品系列（BSA 0-2mg/mL）
3. 样品稀释
4. WR + 样品（50:1）
5. 37°C孵育30min（或室温60min）
6. 冷却至室温
7. A562测定
8. 标准曲线计算

四、Bradford法

4.1 原理

Bradford法（考马斯亮蓝）：
├─ 考马斯亮蓝G-250
├─ 与蛋白质结合后
├─ 从红色变为蓝色
├─ λ = 595nm
└─ 蛋白质-染料复合物

4.2 特点

Bradford法特点：
├─ 高灵敏度：A595nm
├─ 快速（5min）
├─ 线性范围：0.1-1.5mg/mL
├─ 缺点：干扰剂多
└─ 颜色稳定30min-1h

干扰物质：
├─ 去污剂：SDS, Triton
├─ 还原剂：DTT, β-ME
├─ 强碱/强酸
└─ 高盐浓度

五、核酸干扰与校正

5.1 核酸干扰

核酸干扰：
├─ 核酸在280nm也有吸收
├─ 干扰蛋白质测定
├─ A260/A280比值
└─ 核酸/蛋白质比值

常见干扰：
├─ DNA：A260强
├─ RNA：A260/A280≈2.0
└─ 污染导致比值异常

5.2 校正方法

校正公式：
C_protein (mg/mL) = 
  (1.55 × A280) - (0.76 × A260)

或：
C_protein (mg/mL) = 
  A280 × 1.5 - A260 × 0.75

前提：核酸是主要杂质

5.3 纯度判断

纯度指标：
├─ A260/A280比值
├─ 纯蛋白质：≈0.57
├─ A260/A280 > 0.6：核酸污染
├─ A280/A260比值
└─ 纯蛋白质：≈1.75

六、总结

蛋白质浓度UV-Vis测定方法：

选择方法时考虑：灵敏度需求、样品特性、干扰物质、操作时间。作为专业的光谱仪生产厂家，辰昶仪器（choptics.com）提供全面的蛋白质分析UV-Vis解决方案。

整理日期：2026年6月 | 来源：choptics.com